微生物菌种常规5种保藏技术

术语和定义

微生物：广泛分布于自然界中的一群肉眼看不到的微小生物，包括细菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体、放线菌、真菌、病毒等类，其结构简单，以单细胞、细胞群体或非细胞状态存在，在提供营养物质和适宜环境的条件下，一般都能独立生活，迅速生长繁殖。

微生物菌种：可培养的具有保藏价值的微生物纯培养（株）。

菌种保藏：微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有形状基本稳定，以便于研究、交换和使用的目的。

一、定期移植保藏法

释义：亦称为传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，*适条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4℃~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

适用范围：本方法广泛适用于细菌、放线菌、酵母、真菌等的短期保藏。

原理：保藏培养基一般含有机氮多，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌种性能。大多数在低温条件下保藏可大大减缓菌种的代谢活动，抑制繁殖速度，降低突变频率，延长菌种保藏时间。

操作：具体操作是把目的菌种接种于适宜的培养基上，置合适温度下培养一定时间(不可太久，否则会衰老)，然后放在4℃左右下冷藏。每间隔一段时间应重新移植、培养一次，如此不断更新。在一般情况下，各种微生物移植一次的时间为无芽孢细菌1～2个月，芽孢样菌3～6个月，放线菌3～6个月，酵母菌4～6个月，丝状真菌4～8个月，担子菌3～6个月。

优缺点：本法的优点是操作简便，不需特殊设备，能随时接种和及时观察菌种是否死亡或被污染等情况缺点是保藏时间短，菌种易变异、退化，以及人力、物力的花费较大等。

二、液体石蜡保藏法

释义：亦称为矿物油保藏法，是定期移植保藏法的改良方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基或半固体培养基上，*适条件下培养至对数生长期后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面或半固体，再通常直立放置于4℃~10℃进行保存的一种菌种保藏方法。

适用范围：本方法适用于不能分解液体石蜡的酵母菌、某些细菌(如:芽孢杆菌属、乙酸杆菌属等)和某些丝状真菌(如:青霉属、曲霉属等),而某些细菌(如:氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等)和一些真菌(如:卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等)不宜采用此法进行保存。

原理：液体石蜡保藏法可作为定期移植保藏法的辅助方法。在液体石蜡覆盖下,菌种的生物代谢受到抑制,细胞老化被推迟。此方法可阻止氧气进入,使需氧菌不能继续生长,也可防止因培养基的水分蒸发面引起的菌体死亡,达到延长菌种保藏时问的目的。

操作：将菌种接种于适合的斜面培养基上，*适条件下培养至待到健壮的菌体后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4~6℃）干燥处进行保藏。

优缺点：是定期移植保藏法的改良方法，较定期移植保藏法保藏时间更长，并具有厌氧选择性，制作简单、不需特殊设备,且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅。

三、沙土管保藏法

释义：属于载体保藏法的一种,是指将培养好的菌种用太菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀,或直接将菌苔或孢子刮下接种于火菌的沙土管中,使其吸附在载体上,将管中水分抽干后熔封或石蜡封口,置干燥器中于4℃~10℃进行保存的一种菌种保藏方法。

适用范围：本方法适用于产孢类放线菌、芽孢杆菌、曲霜属、青霉属以及少数酵母(如:隐球酵母和红酵母等),不适用于病原性真菌的保藏,特别是不适于以菌丝发育为主的真菌的保藏。

原理：利用细沙土创造的干燥条件,使那些能产生刑子或芽孢的微生物,在干燥环境中代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制,抵抗力强,不易死亡。此方法可减少菌株突变,延长存活时间。

操作：沙土管制备、斜面培养物的制备、制备菌悬液，均匀滴入沙土管中（放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中，用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器内，纯培养检查，将纯培养检查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低温(4℃-15℃)干燥处，半年检查一次活力及杂菌情况。也可将纯培养检查合格的沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。用此方法保藏时间为2-10年不等。

优缺点：这种方法在抗生素工业生产中应用*广.保藏效果亦较好,可以达到2年左右。但是此法对于营养细胞效果不好，操作的时候应该注意抽干一步务必要快,尽量在12h内完成,防止孢子萌发,降低保藏效果。

四、低温冷冻保藏法

释义：将菌种保藏在-60℃~-80℃低温冰箱中以减缓其生理活动的一种菌种保藏方法。

适用范围：本方法适用于大多数需要长期保藏的细菌、真菌、放线菌、病毒等。

原理：大多数微生物可在-60℃及以下的低温中保藏。通过低温，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度越低，效果越好。

操作：将含菌种的冻存管插入保藏塑料盒中置于-60℃~-80℃低温冰箱中保藏,保藏期间应定期检查活力及杂菌情况。保藏周期一般1年~5年。

优缺点：保存周期长，但需要-60℃~-80℃的超低温冷冻环境。

五、冷冻干燥保藏法

释义：亦称冻干法,是在无菌条件下将欲保藏的菌种制成悬浮液后冻结,在真空条件下使冰升华直至干燥,从而使微生物的生理活动趋于停止面长期维持存活状态的一种菌种保藏方法。

适用范围：本方法适用于保藏大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等，但不适于保藏不产孢子的丝状真菌等。

原理：冷冻干燥保藏法是在低温、干燥、缺氧条件下保藏菌种。即在低温条件下快速地将菌种冻结,使微生物保持完整,然后减压抽真空使冰升华直至脱水干燥,并在真空状态密封隔绝空气,使微生物代谢活动停止,得以长期保藏。

操作：制备菌悬液,与保护剂混匀，装入无菌的安瓿瓶中,于低温冰箱中预冻至-15℃~-20℃，启动冷冻真空干燥机的真空泵，使之完全干燥，,在真空状态下融封安瓿瓶,低温避光保藏。

优缺点：冷冻干燥法虽然操作复杂,需要使用冷冻干燥以及抽真空的设备,然而一旦保存好,则可以*小程度地减少微生物的改变、死亡和泄露扩散,因此适用于大批量菌种的长期保存,特别是一些致病微生物的保存.该法是各种保存方法中*为有效的方法之一,对于大多数微生物都适用,包括一些难于保存的致病菌,如脑膜炎球菌和淋病球菌.